编者按国际眼科时讯
神经节细胞是视网膜神经回路的主要组成部分，但在体人眼中难以观察和量化。众所周知，在活体人视网膜中神经节细胞及其他透明神经元进行成像和量化，对青光眼的诊断和治疗具有重要意义。美国印第安纳大学研究人员新近发现一种成像技术，对半透明细胞具有非常高的分辨率和对比度，而且这种光学显微镜灵敏度也非常高。《国际眼科时讯》为您带来精彩介绍。
技术概述据隶属美国NIH的国家眼科研究所（NEI）预测，在~年间，美国青光眼患者数量将增加一倍以上，从万人次增长到万人次。青光眼通过破坏视网膜细胞而导致失明，视网膜细胞可将光刺激转化为电脉冲，并将其传送到大脑。来自印第安纳大学视光学院的DonaldT.Miller教授表示，在患者进行青光眼检测之前，已经存在数千个细胞的死亡。
Miller教授还表示，细胞非常小且透明度很高，如果眼科医生能够更早地发现这些细胞损伤，临床上可以极大程度上改善青光眼以及其他视网膜疾病的诊断和治疗。他的团队发明了一种新的非侵入式眼科显微镜，用来观察视网膜细胞，其研究公布于PNAS上。
该文献的第一作者LiuZhuolin是Miller研究所中一员，他说到，这项技术可以使眼科医师能够在首诊时便观察到视网膜神经节细胞，并且可以进行细胞计数，进而再结合其他临床检查设备对青光眼损害程度进行评估。这项技术最初应用于天文学中，主要目的是消除望远镜中大气模糊的影响。该方法还提高了OCT的性能，而且其原理是利用光学，所以也是一种无创检查，可以反复检测同一细胞。通过不同程度的聚焦，我们可以获取视网膜不同厚度细胞的图像。
图像的获取方式神经节细胞（GCs）是视网膜神经回路的主要组成部分，其可以处理光感受器信号并通过轴突向大脑传递该信息。然而，关于它们在视觉上的作用及其对致盲性疾病的易感性，我们仍然知之甚少。在研究过程中遇到的主要瓶颈问题是无法观察GCs以及其在活体人眼中的退化情况。尽管活体视网膜细胞成像光学技术已经发展了20年，但由于GCs具有高透明度，仍然难以实现对GCs的观察。传统的成像技术（主要是单分散光）无法成功观察到GCs，且易聚焦于多粒子散射、荧光、双光子和相位成像以增强对GCs的对比度。
此次研究中，研究者发现单个散射光实际上携带了大量可以反映GC胞体、轴突和其它视网膜神经元的信息，并对这些进行了定量分析。在GCs神经层上进行形态测量，包括对光感受器的预测和对GCs主亚型的识别，甚至涵盖了神经纤维下的神经元。
此项技术通过以下方式获取单分散图像：
（1）将自适应光学系统与光学相干断层扫描相结合，以避免眼球光学所致图像模糊；
（2）行3D亚细胞图像拍摄，以避免眼球运动所致图像模糊；
（3）在胞体内部使用细胞活性作为一种内在对比剂。
此外，通过聚焦成像技术可以将单个GCs映射到潜在的无长突、双相水平相感光细胞和视网膜色素上皮细胞，进而为视觉信息的神经元处理提供解剖学基础。这种成像模式也是一种提高临床诊断和评估视网膜疾病的良好工具。
视网膜是一种反向叠加的神经元，需要光穿过其全层后才能被光感受器所吸收，进而才能启动视觉。因此，光受体前的视网膜神经元（包括神经节细胞）几乎都是透明的，并且与周围的细胞相匹配。这些结构特性，以及GCs间的紧密连接、眼球所导致的模糊以及视网膜运动，都使记录活体人视网膜的这些神经元图像极具挑战性。体外研究可以克服这些问题，主要通过消除视网膜运动、使用染色剂和荧光标记,双光子激发、微分子干涉对比光学以及极好的3D分辨率来增强对比度。最近，一些强有力的方法已经成功地应用于活体动物身上，譬如双光子激发，但仍需将研究转移到人类身上。然而，在体人视网膜成像的标准方法，包括眼底摄影、扫描激光检眼镜（SLO）和OCT，由于分辨率不高、轴向切面、细胞对比度不够以及眼球运动伪影矫正等原因，无法对GCs和其他透明神经元成像。一些间接方法，譬如从获取的大量视网膜层厚度和临床视野测试中推断神经元的数量，可以避免这些问题，但结果的可靠性还需要进一步证实。
新技术图像展示图1.AO-OCT图像
图2.视网膜的三维成像
（请在wifi的情况下观看）
图3.GCL胞体
（请在wifi的情况下观看）
（请在wifi的情况下观看）
图4.在视网膜上观察GCs和其他神经元
对临床工作的重要意义这种光学显微镜不仅可以观察到这些细胞的形态，还可以显示了它们的三维立体结构、主要亚型以及对其他神经元的空间投影关系。该方法可以让我们观察到构成视网膜神经元、神经胶质的多种亚型以及视网膜血管情况，进而可以揭示神经元处理视觉信息的解剖学基础。从临床方面讲，视网膜神经元的高分辨率图像有助于提高诊断水平，并有利于评估神经节细胞的治疗方案和效果，以及评估视网膜疾病中其他神经元的损害。
在体视网膜神经元的高分辨率图像也有望改善视神经的GCs和轴突损失的诊断和治疗监测，譬如青光眼及其他神经退行性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症。
此项技术的愿景研究团队目前正在努力使这一技术对细胞的生理活性具有敏感性。如果可以做到这一点，那么即将开辟一个之前无法想象的新方法来绘制视网膜神经回路的功能方面图像，并在最早期检测到与疾病相关的细胞学变化。Miller教授表示将这种技术整合到OCT中需要得到联邦政府的批准，而且商业化比目前实验室研究更容易满足临床使用需求。
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